李向梅1,2 ，王戰輝1， 肖希龍1，王照鵬2，溫 凱1，吳小平2，夏  曦1，武晉孝3，江海洋1 

（1中國農業大學動物醫學院，北京 100193；2北京維德維康生物技術有限公司，北京 100095；3山西省飼料獸藥監察所，山西 030027）

摘要：【目的】喹諾酮類藥物和慶大霉素均為、廣譜抗生素，對大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有顯著的抗菌效果，是中國畜牧業和水產業中常用的兩類獸藥。由于這兩類藥物在動物源性食品中的殘留可能導致對人類健康的危害，因此，為了保護消費者的健康，研究和制定動物源性食品中同時檢測這兩類藥物的殘留檢測方法對完善中國的食品安全監測體系具有重要意義。【方法】建立了同時檢測牛奶中13種喹諾酮類和慶大霉素殘留的膠體金免疫層析方法。利用獲得的喹諾酮類和慶大霉素單克隆抗體，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，并對這兩類抗體按比例進行混合標記。同時，采用方陣法系統研究了膠體金標記這兩類抗體時的pH值和抗體用量對靈敏度的影響，并對這兩類藥物抗原的包被條件進行選擇確定。在此基礎上研發出可同時檢測牛奶中13種喹諾酮類藥物和慶大霉素的膠體金快速檢測試紙條，試紙條采用直接競爭法原理。【結果】該方法可同時檢測恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星、氟甲喹、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、噁喹酸、麻保沙星、氟羅沙星、奧比沙星、達氟沙星和洛美沙星這13種喹諾酮類藥物和慶大霉素，對其他喹諾酮類藥物如：沙拉沙星、二氟沙星、司帕沙星、帕珠沙星等無交叉反應，同時對其他氨基糖苷類藥物如：鏈霉素、新霉素、卡那霉素也無交叉反應。該試紙條對牛奶中這13種喹諾酮類藥物和慶大霉素的檢測限均為20 ng·mL-1，*國家對這兩類藥物的殘留*。牛奶樣本直接檢測，無需處理，整個檢測過程5 min內完成。【結論】采用該方法和HPLC-MS/MS對60份牛奶盲樣進行對比檢測，陽性樣品全部檢出，同時篩選方法未出現假陽性和假陰性現象，二者的測定結果基本相符，表明該方法準確可靠，適用于現場大批量樣本的快速檢測和篩選。實際操作過程中，可以采用膠體金免疫層析對樣品進行現場快速初篩；篩選的疑似陽性樣品，可以采用HPLC-MS/MS方法對樣品中QNS和GEN的含量進一步確認。

關鍵詞：喹諾酮類；慶大霉素；殘留；膠體金免疫層析

Development of a Colloidal Gold Immunochromatographic Technique for Simultaneous Detection of Quinolones and Gentamicin in Milk

LI Xiang-mei1,2，WANG Zhan-hui1，XIAO Xi-long1，WANG Zhao-peng2，WEN Kai1，WU Xiao-ping2，       XIA Xi1，WU Jin-xiao3，JIANG Hai-yang1

(1College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193；2Beijing WDWK Biotechnology Company, Ltd., Beijing 100095；3Shanxi Institute of Feed and Veterinary Drugs Control, Shanxi 030027)

Abstract:【Objective】Quinolones and gentamicin are highly effective and broad-spectrum antibiotics. They have significant antibiotic effects on gram-negative and gram-positive bacteria, and are widely used in agriculture in China. Because these two types of drug residues in foods of animal origin may cause harm to human health, therefore, in order to protect the consumers’ health, it is necessary to develop a detection method for simultaneous monitoring these two types of drugs residue level in food. A colloidal gold immunochromatographic method was developed for the simultaneous detection of 13 quinolones and gentamicin residues in milk.【Method】In this study, based on the quinolones and gentamicin monoclonal antibodies, the colloidal gold particles were prepared by sodium citrate reduction method, and mixed labeled with same ratio of these two types of monoclonal antibodies. The effect of pH and antibody amount for gold-antibody conjugation on the strip test sensitivity was investigated. Meanwhile, the coating condition of these two types of antigens was selected. A colloidal gold rapid test strip was developed to simultaneously detect 13 quinolones and gentamicin residue in milk on these bases, and the test strip using the principle of direct competition.【Result】The results showed that the method can simultaneously detect 13 quinolones and gentamicin. These 13 quinolones include enrofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin, flumequine, pefloxacin, ofloxacin, enoxacin, oxolinic acid, marbofloxacin, fleroxacin, orbifloxacin, danofloxacin and lomefloxacin. The test strip has no cross-reaction to other quinolones such as sarafloxacin, difloxacin, sparfloxacin and pazufloxacin, etc. At the same time, it has no cross-reaction to other aminoglycosides such as streptomycin, neomycin and kanamycin. The limit of detection was estimated to be 20 ng·mL-1 in milk for both the 13 quinolones and gentamicin, since the detection test line on the strip test compley disappeared at this concentration. The detection limit for milk sample of these two types of drugs fully meets the detection limit requirements of China. Samples were detected directly without treatment, and the entire testing process was completed within 5 min.【Conclusion】A parallel analysis of quinolones and gentamicin in 60 blind raw milk samples conducted by HPLC-MS/MS showed comparable results to those obtained from the strip test. All positive samples were detected while false positive and false negative phenomenon did not appear with this screening method. The results demonstrated that the developed method is suitable for the onsite determination of quinolones and gentamicin residues in a large number of samples. Since this method provides only qualitative and semiquantitative results, the determined positive samples should be further confirmed by more sensitive methods such as HPLC-MS/MS.

Key words: quinolones; gentamicin; residue; colloidal gold immunochromatographic

0  引言

【研究意義】喹諾酮類（QNS）和慶大霉素（GEN）均為廣譜、抗生素，對大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有顯著的抗菌效果，因此是農業、畜牧業和水產業中常用的獸藥，也常被添加到飼料中促進動物的生長發育[1-2]。隨著這兩類藥物在畜牧養殖業的不斷應用，其殘留問題日趨嚴重，在動物性食品中的殘留不僅危害人的身體健康，如QNS可引起惡心，嘔吐，影響軟骨發育，GEN具有耳毒性和腎毒性，還污染環境、影響新藥開發和臨床用藥，而且不利于養殖業的健康發展及畜禽產品的出口；更為嚴重的是動物性食品中殘留較低濃度的藥物容易誘導人類致病菌產生耐藥性，不利于該類藥物對人類疾病的治療。為嚴格控制這兩類抗生素在動物源食品中的殘留，保證人民身體健康，保證進出口產品質量，提高中國畜產品的信譽，中國*第235號公告對這兩類藥物在動物源性食品中的zui高殘留*（MRLs）均作了明確規定[3]。因此，研究這兩類藥物的殘留檢測方法對中國的食品安全監測具有非常重要的意義。【前人研究進展】目前國內外用于動物源食品中QNS和GEN殘留檢測的分析方法主要有微生物法[4]、放射化學法[5]、免疫分析法[6-10]（包括放射免疫法、酶聯免疫法、熒光免疫法、免疫傳感器和蛋白芯片）、薄層色譜法[11]、毛細管電泳色譜法[12-13]、液相色譜法[14-16]、氣相色譜-質譜法[17]、液相色譜-質譜法[18-20]等。微生物方法所需設備簡單、價格低廉, 適合于大批樣品的檢測；但是該法存在菌種不易篩選, 影響因素復雜、檢測耗時長、穩定性差、度低、靈敏度低的特點, 往往不能滿足目前實際檢測工作的要求。液相色譜、質譜聯機等儀器方法靈敏度高，可以提供定量及確證分析，但是前處理復雜，需要昂貴的儀器，且對操作人員有專業的要求，不適合基層檢測分析。【本研究切入點】免疫分析法是近年來快速發展的一種方法, 具有靈敏度高、特異性強、適用范圍廣、操作簡便、快捷、成本低廉及現場適應能力強等優點。膠體金免疫層析法與其他免疫方法如ELISA 相比，樣品前處理簡單，不需任何儀器， 結果可在5—10min內獲取，且對操作人員沒有專業要求，非常適合現場大批量樣本的篩選。但目前國內外還未出現可同時檢測QNS和GEN兩類藥物的膠體金免疫方法的報道。【擬解決的關鍵問題】建立同時檢測牛奶中QNS和GEN兩類藥物殘留的膠體金免疫層析方法。

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